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交叉引物恒溫擴增技術

發布時間:2017-11-13 11:50:32  瀏覽次數:471

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核酸擴增是核酸分子診斷的關鍵技術。根據核酸擴增反應中溫度變化要求,可以將核酸擴增技術分為兩大類:一類是PCR核酸擴增技術,另一類是核酸恒溫擴增技術。

PCR技術是指通過控制溫度的變化來實現DNA擴增的三個步驟:模板變性(如95℃)-引物雜交(如58℃)-DNA合成(如72℃)。這種溫度變化的循環重復(如重復35次)過程通常由精密而復雜的儀器(PCR儀)來控制。核酸恒溫擴增技術(Nucleic Acid Isothermal Amplification,NAIA)則是擴增反應的全過程均在同一溫度下進行,不須象PCR反應那樣需要經歷幾十個溫度變化的循環過程。這一特點使得它們對擴增所需儀器的要求大大簡化,反應時間大大縮短,因而具有巨大的應用價值,成為分子診斷行業發展中的熱點。

目前的NAIA技術主要有滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification,RCA)、轉錄酶擴增技術 (Transcription Mediated Amplification,TMA)、依賴核酸序列擴增技術 (Nucleic Acid Sequence Based Amplification,NASBA)、鏈置換擴增技術(strand displacement amplification,SDA)、環介導的等溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、解鏈酶擴增技術(Helicase Dependent Amplification,HDA)。上述各種核酸擴增技術均由國外公司所擁有。

交叉引物擴增技術(Crossing Priming Amplification,CPA)是完全由優思達公司獨立研發成功的一種新的核酸恒溫擴增技術,也是中國首個具有自主知識產權的核酸擴增技術。CPA與優思達公司其他技術相結合(如快速核酸提取技術、核酸試紙條檢測技術等),形成一個完整的現場快速分子檢測平臺,可以開發出眾多恒溫擴增檢測試劑盒,廣泛應用于分子診斷、防疫檢疫、生物醫學研究、個體化治療等領域。該技術已申請中國和美國發明專利,在美國《Molecular Diagnostics》等雜志發表論文二篇,并通過了比爾•蓋茨基金會資助申請。

CPA擴增體系中除包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶外,還主要包括擴增引物和兩條交叉引物。這些寡聚核苷酸鏈能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性,使DNA的循環擴增能不斷的實現。CPA擴增主要包含以下幾個步驟:
    交叉正向引物CPF中的PFs與模板DNA中PFa互補,啟動DNA合成,使得PRa被引入到所擴增的產物中;
    外圍引物DP1s與PFa前端DP1a序列互補,通過鏈置換型DNA聚合酶向前延伸,一邊置換CPF合成的能與CPR和DP2a結合的單鏈產物(結構3),一邊與模板DNA形成雙鏈產物(結構2);
    在結構3中,DP2a通過鏈置換型DNA聚合酶向前延伸,置換出由CPR所延伸的單鏈產物(結構5),同時合成與步驟2中由CPF延伸所產生單鏈DNA形成雙鏈產物(結構4),而結構5相對起始的DNA模板,多了PRs和PFs兩個片段序列;
    單鏈結構5中的3’端的PFa和PRs可分別與CPF中的PFs和CPR中的PRa互補結合, 可在鏈置換型DNA聚合酶的作用下延伸和置換出相應的單鏈產物。延伸產物相對結構5來說又增加了一個PFs區域(結構8);
    因此,擴增引物CPF和CPR的不斷雜交和延伸,不僅使得結構5的長度不斷的加長,從而引入更多CPF和CPR 3’端互補區域,同時也置換出了各種可與CPF和CPR 3’端互補的單鏈產物;
    通過CPF和CPR的不斷雜交延伸和DNA聚合酶的鏈置換作用,使得DNA拷貝數不斷的增加,從而達到基因擴增的效果。

使用本裝置提取臨床生物樣品的核酸成本低廉,只需幾分鐘,可以應用于現場檢測或實驗資源較少的基層醫院和經濟不發達地區;同時也可以滿足大醫院特定情況下的需求,如急診或床邊的核酸快速診斷。該技術已申請發明專利,并取得蓋茨基金會研發資助。

CPA基本原理如下:
 
  圖2 CPA擴增的反應原理圖

與目前廣泛使用的熒光PCR技術相比較,CPA技術有以下幾個優點:
    反應速度快:反應時間約1小時,使試劑盒可用于檢驗檢疫、突發性傳染病的檢測與監控現場檢測或醫院的床邊診斷(Point-of-Testing, POCT);
    檢測成本低:目前熒光光定量PCR儀價格昂貴,無法在很多中小醫院普及。CPA擴增只需要離心機和一臺簡單的恒溫裝置,如普通的水浴鍋、金屬浴,即可進行擴增。
    操作簡單:對操作人員的技能要求不高,絕大多數人通過簡單培訓或自學都可掌握,為核酸檢測試劑的廣泛應用創造了條件。

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